塩素の効能

May 18, 2023

npj クリーンウォーター 4 巻、記事番号: 48 (2021) この記事を引用

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メトリクスの詳細

塩素溶液は、生物学的に安全な飲料水の製造に広く使用されています。 使用時点 [POU] 飲料水処理システムの機能は、集中処理システムや配水ネットワークが実用的ではない場所で関心を集めています。 この研究では、POU 飲料水用途で使用される 3 つの塩素系消毒剤 (次亜塩素酸イオン [OCl-]、次亜塩素酸 [HOCl]、および電気化学的に活性化された溶液 [ECAS]) の抗菌および抗バイオフィルム活性を調査しました。 相対的な抗菌活性は、大腸菌を使用した殺菌懸濁液アッセイ (BS EN 1040 および BS EN 1276) 内で比較されました。 抗バイオフィルム活性は、疾病管理センター [CDC] バイオフィルム リアクター内で確立された固着性緑膿菌を利用して比較されました。 HOCl は、有機負荷 (ウシ血清アルブミン) の存在下、遊離塩素が 50 mg L-1 以上の浮遊性大腸菌に対して最大の抗菌活性を示しました。 しかし、ECAS は、遊離塩素 50 mg L-1 以上で、OCl および HOCl と比較して、緑膿菌バイオフィルムに対して有意に高い抗バイオフィルム活性を示しました。 この証拠に基づいて、HOCl が主な塩素種である消毒剤 (HOCl および ECAS) は、POU 飲料水用途に適切な代替塩素ベースの消毒剤となるでしょう。

人間の病気の主な原因は、生物学的に汚染された水の摂取によるものです1。 これは、平均して推定人口の 30% が、低所得国 (つまり、1 人当たりの国民総所得 [GNI] が 1,025 ドル未満) および後発開発途上国 (持続可能な開発に対する深刻な構造的障害に直面している 46 の低所得国) に特に関係します。基本的な衛生サービスを利用できる2. これは、生物学的に安全な水の生産と供給を確保するために主に集中型飲料水処理システムを利用しているアッパー中流国（1人当たりGNIが4,036ドルから12,475ドル）や高所得国（1人当たりGNI > 12,476ドル）とは対照的です3。 飲料水消毒の主な役割は、病原微生物を制御し、処理された水が生物学的に安全に飲めるようにすることです。 次亜塩素酸ナトリウム [NaOCl] の形の塩素は、低コストで効果的な抗菌特性があるため、最も一般的な消毒剤です4。 再分配ネットワーク内に残留塩素 (0.5 ～ 5 mg L-1) が存在すると、微生物の再増殖が制限され、配達時点で生物学的に安全な水を維持するのに役立ちます3。 糞便の存在を推測する大腸菌、全大腸菌群、腸球菌、ウェルシュ菌3,5などの指標微生物は、消毒処理プロセスの有効性を確保するために監視されます。 潜在的な病原性があるため、処理水中のこれらの指標微生物の推奨限度はゼロ CFU 100 mL-1 です。 残念なことに、塩素消毒剤を使用すると、トリハロメタン 8 やハロ酢酸 9 などの消毒副産物 [DBP]6,7 が生成されます。 このような副産物は、変異原性および発がん性の特性を示すことが知られており 10、したがって非常に望ましくない。

Point-of-use [POU] drinking water treatment systems do not require distribution networks and therefore negate the need to maintain residual chlorine levels. The World Health Organization recommends free chlorine concentrations of between 0.2 and 0.5 mg L−1 at point of delivery and use3. The use of conventional chlorine-based disinfectants, such as hypochlorite (OCl-), within POU water disinfection requires the storage and transportation of hazardous chemicals and can also cause the formation of harmful DBPs and the deterioration of taste and odour11. Ultraviolet and ozone are well established as disinfection technologies within both decentralised/POU12,13 and large scale drinking water treatment14,3.3.CO;2-1." href="/articles/s41545-021-00139-w#ref-CR15" id="ref-link-section-d222113761e520">しかし、電気化学的に活性化されたソリューション [ECAS] を導入することの追加の利点は、食料生産の一部として水処理システムの外部で使用できることです 16,17 または医療現場 18,19。 限られた数の研究では、分散型消毒用途に一般的に使用される塩素剤と ECAS を比較しています 20,21。 これらの予備研究は有望でしたが、どちらの研究も研究した ECAS の pH やバイオフィルムに対する ECAS の有効性を報告していませんでした。

電気化学的消毒技術は水分野で出現しつつあり8,22、現在では食品分野で十分に確立されており16,17、程度は低いですが臨床/医療現場でも確立されています18,19。 ECAS の生成は以前に詳細に説明されています 19 。ECAS は、別々の陽極コンパートメントと陰極コンパートメントを備えた電気化学セルに食塩水を通過させることによって生成されます。 陽極溶液は酸化還元電位 [ORP] 値が +1000 mV を超え、酸化力が非常に高くなります 23,24。 これらの ORP 値では、アノードの表面で形成される酸化的一時的 (準安定) 抗菌種の結果として、アノード溶液は本質的に酸性 (pH 2 ～ 5) になります。 酸性 pH 値では、主要な抗菌化学種は次亜塩素酸 [HOCl] (>95%) と溶存塩素 [Cl2] (<5%) によって支配されます 25,26。 追加の準安定抗菌種には次のものがあります。 OH-、O3、H2O2、および O2- も生成されると理論化されていますが、活性溶液内の寿命と活性については議論があります 27,28。 ECAS の抗菌特性は、観察された高い ORP 値を引き起こす HOCl と準安定種の組み合わせから生じます。 このような溶液の作用機序は細胞膜の内外の物理的破壊であり 19,29 、エネルギー生成機構などの微生物の機能の破壊や機能不全につながります 23。

ほとんどの微生物は浮遊状態で存在するのではなく、表面または基質に付着し、バイオフィルムとして知られる固着性コミュニティを確立することが現在では理解されています 30,31。 天然に存在するバイオフィルムには、細菌、藻類、真菌、原生動物を含む複数種の微生物が含まれており、塩素を含む消毒剤などの外部ストレスから保護するための適応として、細胞外ポリマー物質 [EPS] に包まれています 32,33。 飲料水処理システム内のバイオフィルムの存在は、水質を維持する上で懸念される領域とみなされています 34,35。 パイプやフィルターなどのインフラ上でバイオフィルムが形成されると、生物付着が生じ、運用時間が短縮され、材料の腐食が引き起こされる可能性があります 36,37。 特に、バイオフィルムは、大量の水供給源への娘細胞の脱落を通じて、病原体の貯蔵庫として機能することが知られています38。 水系病原体は糞便汚染に由来することが多く（大腸菌 O157:H7 など）、未治療のまま放置すると致命的な胃腸疾患を引き起こす可能性があり、さらに日和見病原体（カンピロバクター種、レジオネラ種、緑膿菌など）は呼吸器疾患を引き起こす可能性があります。または消化管感染症と疾患38。 バイオフィルム内の細菌の抗菌薬に対する感受性が低下していることが懸念されています。 OCl- などの反応性塩素種は、効果的な殺生物作用を発揮するのに十分なほどバイオフィルムの細胞外ポリマーマトリックスに浸透できないことが証拠によって明らかにされています 39,40。

この研究の主な目的は、POU 飲料水システムで使用する OCl-、HOCl、および ECAS の抗菌活性とバイオフィルム阻害を調査することでした。 OCl-、HOCl、および ECAS の殺菌活性は、バルク水中の微生物負荷を減らすという観点から、モデル病原微生物として大腸菌を利用する標準的な化学消毒剤アッセイを使用して比較されました。 さらに、この研究では、確立された緑膿菌バイオフィルムの密度を低減する際の OCl-、HOCl、および ECAS の有効性も調査しました。

大腸菌 ATCC 10536 に対する 3 つの試験消毒剤の抗菌活性は、標準的な殺菌方法 BS EN 1040 および 127641,42 を使用して評価されました。 どちらの方法でも、対象微生物の 5-log 減少は、存在下 (BS EN 1276) または非存在下 (BS EN 1040) のいずれかにおいて、実験パラメータで定義される殺菌活性を有する製品と定義するために必要な最小閾値です。有機的な負荷の。 これには、POU 飲料水処理システムの投入水に存在する大腸菌から予想される量（約 2.06 ± 1.91 log10 CFU 100 mL-1）よりも多くの開始接種量（8.54 ± 0.27 log10 CFU mL-1）が必要です43。

図 1 は、有機負荷 (BS EN 1040) が存在しない場合の大腸菌に対する OCl-、HOCl、および ECAS の抗菌活性を示しています。 遊離塩素（FC）濃度 ≥50 mg L-1 では、すべての消毒剤が試験アッセイ条件下で必要な対数減少（5 log CFU mL-1）を達成しました41。 FC 濃度 25 mg L-1 では、OCl- は ECAS および HOCl の両方と比較して抗菌活性の大幅な低下を示しました (p < 0.0001)。 OCl- については、3.80 ± 1.246 log10 CFU mL-1 の減少が観察されました。これは、実施した試験アッセイの条件によって定義される、製品が殺菌活性を有すると定義するために必要な 5-log 減少を大幅に下回っています。 同じ濃度 (25 mg L-1 FC) では、HOCl は完全な対数減少 (7.366 ± 0.048 log10 CFU mL-1) をもたらしましたが、ECAS は 5.676 ± 0.807 log10 CFU mL-1 の減少をもたらしました。 表 1 は、NaOCl、HOCl、および ECAS の大腸菌の 5-log 減少に対する CT 値を示しています。 CT 値は、消毒剤 (遊離活性塩素など) の濃度と消毒される水との接触時間の積です。 阻害溶液が存在しない場合、HOCl の CT 値 (16.51 mg min L-1) は ECAS (21.98 mg min L-1) より低く、NaOCl の CT 値 (33.81 mg min L-1) の約半分でした。 これらの CT 値は、ECAS および OCl- は、HOCl と比較して同等の対数減少のために、より大きな FC 濃度または接触時間を必要とすることを示しています。

標準化された遊離塩素濃度を使用した大腸菌 ATCC 10536 に対する NaOCl [黒]、ECAS [灰色]、および HOCl [白] の抗菌効果。BS EN 1040 (41British Standards Institution、2005a) を使用して評価されました。 点線は、アッセイの実験条件下で基本的な殺菌活性を実証するために必要な最小対数減少 (5 log CFU mL-1) を表します (n = 3 ± 標準偏差 [sd])。 有意差 (p 値) は、検定後の Tukey 比較を使用した二元配置分散分析によって計算され、信頼区間は 95% (****p < 0.0001; ***p < 0.001) です。 ND = 検出されません。 エラーバーは標準偏差を表します。

図 2 は、低濃度の干渉 (清浄) 有機負荷 (0.3 g L-1 ウシ血清アルブミン [BSA]) の存在下での 3 つの消毒剤の抗菌活性を示しています。 試験した最高の FC 濃度 (150 mg L-1) では、NaOCl (7.30 ± 0.019 log10 CFU mL-1) および HOCl (7.30 ± 0.072 log10 CFU mL-1) が完全に対数減少しましたが、ECAS では 6.96 ± 1.536 log10 CFU mL−1 減少。 したがって、すべての消毒剤は、試験条件に従って有機負荷の存在下で殺菌活性を示しました (BS EN 1276)。 100 mg L-1 FC では、すべての消毒剤が有意な抗菌効果 (>5 対数減少) を示し、3 つの消毒剤間に有意差はありませんでした。HOCl では完全な対数減少が得られ、OCl では 7.871 の対数減少が得られました。 ± 0.74 log10 CFU mL-1 が達成されましたが、ECAS は 6.806 ± 1.09 log10 CFU mL-1 の減少を達成しました。 50 mg L-1 FC では、OCl- は必要な 5-log 減少 (4.531 ± 0.15 log10 CFU mL-1) を達成できず、HOCl と ECAS の両方と比較して抗菌活性が著しく低くなりました (p < 0.0001)。 HOCl 処理と ECAS 処理の間に有意差はありませんでした (p > 0.05)。 試験した最低のFC濃度（25 mg L−1）では、ECASは細菌負荷を5 log10 CFU mL−1以上減少させる唯一の消毒剤であり（図2）、6.077 ± 1.441 log10 CFU mL−1の対数減少をもたらした。 OCl および HOCl 処理で得られた対数減少はどちらも ECAS よりも有意に小さく (p < 0.001)、HOCl では 3.207 ± 0.505 log10 CFU mL-1 の対数減少が得られ、これは 1.945 ± 0.222 log10 CFU mL よりも有意に大きかった。 OCl- により示された -1 log 減少 (p = 0.0011)。 低有機負荷での OCl-、HOCl、および ECAS の 5-log 減少 CT 値は、NaOCl が最も高い CT 値 (88.96 mg min L-1) を示し、次に HOCl (34.78 mg min L-1)、次に ECAS を示しました。 (20.94 mg min L−1)。

0.3 g L-1 BSA の妨害溶液を含む大腸菌 ATCC 10536 に対する標準化遊離塩素濃度を使用した NaOCl [黒]、ECAS [灰色]、および HOCl [白] の抗菌効果 (42British Standards Institution、2009)。 点線は、アッセイの実験条件下で基本的な殺菌活性を実証するために必要な最小対数減少 (5 log CFU mL-1) を表します (n = 3 ± sd)。 有意差 (p 値) は、検定後の Tukey 比較を使用した二元配置分散分析によって計算され、信頼区間は 95% (****p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01) 。 ND = 検出されません。 エラーバーは標準偏差を表します。

試験アッセイ内で妨害物質の濃度が 0.3 g L-1 (クリーン BSA 条件) から 3.0 g L-1 (ダーティ BSA 条件) に増加すると、3 つすべての消毒剤が示す抗菌活性に重大な影響がありました (図.3および表1)。 OCl- と ECAS の両方の抗菌活性は、テストしたすべての FC 濃度で、清浄な条件下でのそれぞれの値と比較して有意に減少しました (p < 0.0001)。 HOCl は、50、100、および 150 mg L-1 FC で OCl および ECAS の両方と比較して有意に高い抗菌活性を示し (p < 0.01)、ECAS は NaOCl と比較して有意に高い抗菌活性を示しました (p < 0.05)。 これは CT 値に反映されており (表 1)、HOCl の 5 log 減少 CT 値は 82.91 mg min L-1 ですが、NaOCl または ECAS については抗菌活性が不十分なため、これらの実験条件下では CT 値を計算できませんでした。 5分間の接触時間の終わりに。 試験した最低の FC 濃度 (25 mg L-1) では、試験した 3 つの消毒剤の間で抗菌活性に有意差はありませんでした (p > 0.05)。 ただし、ECAS が最大の対数減少（1.606 ± 0.954 log10 CFU mL-1）をもたらし、次に HOCl（0.978 ± 0.202 log10 CFU mL-1）、OCl-（0.025 ± 0.004 log10 CFU mL-1）でした。 汚れた条件下でテストされた有機負荷は、POU 飲料水システム内で予想される濃度を表すものではありません。 しかし、結果は、飲料水処理の消毒段階を通じて十分な抗菌活性を確保するには、存在する有機物を減らす必要があることを浮き彫りにしています。

3.0 g L-1 BSA の妨害溶液を含む大腸菌 ATCC 10536 に対する標準化遊離塩素濃度を使用した NaOCl [黒]、ECAS [灰色]、および HOCl [白] の抗菌効果 (42British Standards Institution、2009)。 点線は、アッセイの実験条件下で基本的な殺菌活性を実証するために必要な最小対数減少 (5 log CFU mL-1) を表します (n = 3 ± sd)。 有意差 (p 値) は、検定後の Tukey 比較を使用した二元配置分散分析によって計算され、信頼区間は 95% (****p < 0.0001; **p < 0.01; *p < 0.05) です。 ND = 検出されません。 エラーバーは標準偏差を表します。

OCl-、HOCl、および ECAS の抗菌活性は、FC 濃度の関数として、ポリカーボネート [PC] クーポン上に確立された緑膿菌バイオフィルムに対して測定されました (図 4)。 未処理（消毒剤処理なし）の対照ポリカーボネートクーポンから回収された平均バイオフィルム密度は、8.45 ± 0.172 log10 CFU クーポン -1 (n = 18) でした。 試験消毒剤 (OCl-、HOCl、または ECAS) のいずれも、試験したどの FC 濃度でも完全な対数減少をもたらしませんでした。 FC 濃度 150 mg L-1 では、ECAS によってバイオフィルム密度の最大の減少が引き起こされました (3.852 ± 0.914 log10 CFU クーポン -1)。一方、OCl- および HOCl は 2.018 ± 0.393 という有意に低い対数減少 (p < 0.0001) を示しました。それぞれ、log10 CFU クーポン -1 および 2.005 ± 0.419 log10 CFU クーポン -1。 ECAS はまた、100、75、および 50 mg L-1 FC で OCl- および HOCl と比較して有意に高い抗菌活性を示しました (p < 0.01)。 これは、バイオフィルム密度の 2-log (99%) 減少の CT 値に反映されています (表 1 を参照)。 ECAS の CT 値は 87.21 mg min L-1 でしたが、試験したどの FC 濃度でも 2-log 減少が達成されなかったため、OCl- および HOCl の CT 値は決定できませんでした。 しかし、25および5 mg L-1のFC濃度では、NaOCl、HOClおよびECASによって示される抗菌活性に有意差はありませんでした(p > 0.05)。 実際、どの試験消毒剤についても、0 (対照) と 5 mg L-1 FC の間でバイオフィルム密度の有意な減少はありませんでした (p > 0.05)。 全体として、結果は、FC濃度の増加に伴って抗菌効果が増加する用量反応を示しています。 興味深いことに、ECAS では抗菌活性の最大の増加 (p = 0.009) は ≥25 mg L-1 FC で発生しましたが、HOCl および OCl- の最大の増加は 0 ～ 25 mg L-1 で観察されました (p < 0.0001)。

標準化された FC 濃度を使用した、緑膿菌 ATCC 15442 バイオフィルムに対する NaOCl [△]、HOCl [▢] および ECAS [○] の抗菌活性 (n = 9 ± sd)。 [•••] 対照（未処理）処理（0 mg L-1）から回復した平均バイオフィルム密度（CFU クーポン-1）を指します。 n = 18。有意差 (p 値) は、検定後の Tukey 比較を使用した二元配置分散分析によって計算され、信頼区間は 95% (****p < 0.0001; **p < 0.01)。 エラーバーは標準偏差を表します。

これまでの研究では、OCl、二酸化塩素、オゾン、クロラミンなどの一般的な飲料水消毒剤の抗菌活性を、集中ネットワークと流通ネットワークの観点から比較しました44,45。 この研究では、潜在的な POU 飲料水用途について、OCl-、HOCl、および ECAS 溶液の浮遊生物および細菌バイオフィルムに対する抗菌活性を直接比較しました。

ここで報告されたデータは、すべての消毒剤が対照と比較して浮遊性大腸菌に対して顕著な抗菌活性を示したことを示しています。 阻害物質が存在しない (つまり、有機負荷がない) 場合、すべての消毒剤は FC 濃度の増加に伴って抗菌用量反応を示します。 FC 濃度 ≥50 mg L-1 では、OCl-、HOCl、または ECAS の抗菌活性の間に有意差はありませんでした。 一方、25 mg L-1 FC では、HOCl が最大の抗菌活性を示し、次に OCl- と ECAS が続きました。 観察された抗菌活性の違いは、試験消毒剤の化学的性質の違いによって説明できます。 3 つの消毒剤はすべて FC の生成を引き起こし、ネルンストの方程式で示されるように、根本的な放出の化学的性質は化学製剤と物理化学的パラメーター (特に pH) に依存します 19。 たとえば、FC が放出される抗菌メカニズム (したがって速度論) は、NaOCl (次亜塩素酸ナトリウム) と NaDCC (ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム) では異なります。 NaOCl (pH 11.4) の溶解は主に OCl- の形成をもたらしますが、NaDCC (pH 5.6) の溶解は主に HOCl の形成をもたらします 25,46。 ECAS (pH 3.3) の場合、溶解すると塩素種の混合物が生じます。 HOCl と溶存 Cl2 が含まれますが、HOCl が主な種です。 追加の準安定抗菌種も形成されると理論づけられており 28、その結果、ECAS が 3 つの試験消毒剤の中で最も高い ORP (+1134 mV) を有することになります。 OCl- が主な塩素種である塩素系消毒剤は、細胞膜の脂質二重層を通した拡散が非効率であるため、効果が低いことが示されており、したがって酸化は細胞外膜でのみ発生します 47。 対照的に、HOCl は電気的に中性であるため、外側のエンベロープを透過し、内側の原形質膜を通って拡散することができます 47。 これにより、エネルギー生成などの主要な細胞機能に内部酸化損傷が生じ、また細菌 DNA にも損傷が生じます 23,29。

酸化性消毒剤に対する有機負荷の悪影響はよく知られています 47,48。 この研究では、低濃度の有機物質の存在により、OCl-、HOCl、および ECAS によって示される作用機序の違いから生じる用量反応の違いが明らかになりました。 OCl- イオンの半減期 (DT50) は、数分から秒へと数桁大幅に短縮され 49、これは、清浄な BSA 条件下でも NaOCl に見られる有効性の低下を説明しています (図 2、3)。 HOCl の場合、抗菌活性は、清浄な BSA 条件下で 25 mg L-1 FC で大幅に減少しましたが、25 mg L-1 を超える濃度 (つまり、50、100、150 mg L-1) では減少しませんでした。 興味深いことに、低有機負荷（清浄なBSA条件）の有無にかかわらず、FC濃度25 mg L-1でECASによって示される抗菌活性に有意差はありませんでした。 これは、これらの実験条件下では、低濃度の有機物が ECAS の作用機構を過度に妨げないことを示しています。 ECAS は、反応性塩素と酸素種の両方により非常に高い ORP 値 (>+1100 mV) を示し、これらが急速な酸化反応を促進します。 しかし、以前に観察されているように、高濃度の有機物の存在は酸化還元反応 50 を通じて最終的に ORP を低下させ、結果として ECAS の抗菌活性の低下に寄与します 50,51。 興味深いことに、Robinson らによる以前の研究は次のとおりです。 2013年に52は、277日後に検出可能なFCを示さなかったにもかかわらず（例えば、<0.01 mg L-1）、暗所で4℃で398日間保存した場合、ECASの抗菌活性が維持できることを実証した。 これは、抗菌活性の向上に寄与する、塩素由来のもの以外の追加の抗菌種の重要性を示しています。 したがって、これは、同等の HOCl および NaOCl 溶液と比較した場合、清浄な BSA 条件の存在下で 25 mg L-1 の FC での ECAS の抗菌活性がより優れていることの説明に役立ちます。 殺菌アッセイ内で BSA の有機負荷をさらに増加させると (3.0 g L-1; 汚れた BSA 条件)、試験したすべての FC 濃度で OCl- および ECAS の抗菌活性が大幅に減少しました。 比較すると、ＨＯＣｌの抗菌活性は、ＦＣ濃度＞２５ｍｇ Ｌ−１では有意に低下しなかった。 したがって、NaDCC の溶解によって生成された HOCl が、汚れた BSA 条件下で浮遊細菌に対してより優れた抗菌活性を示すことは明らかです。 化学的に誘導された HOCl は、陽極表面で形成される準安定な抗菌種を持たないため、電気化学的に生成された HOCl 溶液よりも安定しています 53。 化学的に生成された HOCl は、太陽光 (UV) にさらされると分解速度が遅くなります 54。電気化学的に生成された HOCl は分解速度が速くなります 55。 これは、POU 処理システムでの使用に最適な消毒剤を選択することの重要性を強調しています。 たとえば、バルク水からの有機物の濾過または除去が標準的な方法ではない場合、または困難な場合には、NaOCl や ECAS と比較して、HOCl の方がより高い抗菌効果が得られます。

バルク水中の微生物負荷を減らすと、インフラストラクチャー上のバイオフィルムの形成も減少し、確立されたバイオフィルムの密度も潜在的に減少します。 したがって、OCl-、HOCl、および ECAS の比較抗菌活性も、ポリカーボネートクーポン上に確立された緑膿菌バイオフィルムに対して測定されました。 試験したすべての FC 濃度で、OCl- および HOCl についてバイオフィルム密度 (および CT 値) の同等の減少が観察されました。 ECAS はテストされた最も効果的な消毒剤であり、87.21 mg min L-1 の CT 値を示しました。これに対し、テストされたどの FC 濃度でも 2 対数の減少が達成されなかったため、OCl- および HOCl については CT 値を計算できませんでした。 塩素などのハロゲン種を含む抗菌消毒剤は、EPS マトリックス物質との反応拡散および吸着相互作用の結果として、バイオフィルム細胞密度の低減効果が低下することが示されています 39,56。 OCl- の高い反応性は、EPS マトリックスとの反応によって急速に中和され、OCl- の浸透、ひいてはバイオフィルム内の細菌細胞への拡散を減少させるため、微生物バイオフィルムに対するその非効率の一因となります40。 したがって、標的微生物と反応するために利用できるハロゲン種の濃度が減少し、したがって CT 値が増加します 40,57。 スチュワートとレイナーら (2001)40 は、同等の浮遊状態と比較して、OCl- は緑膿菌バイオフィルムを 9.9 log10 CFU cm-2 減少させるのに 767 倍遅いと推定しました。

この研究でバイオフィルムに対してテストされた消毒剤は、FC濃度の増加に伴う抗菌剤の用量反応を示しています。 OCl と HOCl の用量反応曲線は有意な差はありませんでしたが、ECAS は、NaOCl と HOCl の両方と比較した場合、FC 濃度 50 mg L-1 以上で有意に高い抗バイオフィルム活性を示しました (p ≤ 0.0021)。 対照的に、浮遊細胞に対しては、HOCl は FC 濃度 50 mg L-1 以上で最大の抗菌活性を示しました (図 1 ～ 3)。 この観察されたバイオフィルムに対する OCl- および HOCl の抗菌活性の低下は、プランクトン性消毒とバイオフィルム消毒の間で CT 値と耐性係数が 10 倍または 100 倍大きいという以前の研究と一致しています 40,47。 OCl- と HOCl は両方とも、反応性が高いため、バイオフィルム EPS との反応を通じて中和されます 40。 逆に、ECAS には顕著な抗バイオフィルム活性があることが観察されています 51,58。 酸性電解水 [EW] の抗バイオフィルム特性は、Ayebah et al.51 によってリステリア モノサイトゲネス バイオフィルムに対して測定され、30 秒および 60 秒の接触時間後に 4.5 log10 減少しました。 微生物バイオフィルムに対する ECAS の推定抗菌作用機序は 2 つあります。 高い ORP (HOCl および OCl- と比較して) は、その酸化能力の増加と準安定な抗菌種を示しています 4,28 が、共有結合の破壊を通じて、多糖類、タンパク質、DNA の複雑な混合物で構成される保護 EPS バリアを破壊します 59 DNA、RNA、タンパク質内60,61。 さらに、ECAS 内の活性塩素種、主に HOCl は電荷を持たないため、EPS を通過して、埋め込まれた細菌細胞と反応する可能性があります 47。

全体として、この研究では、潜在的な POU 飲料水用途について、単一種の浮遊細菌および固着 (バイオフィルム) 細菌に対する 3 種類の塩素系消毒剤の定量的な抗菌および抗バイオフィルム活性を調査しました。 このデータに基づいて、OCl- は浮遊性細菌および固着性細菌集団に対して最も効果的ではないことが示され、HOCl は浮遊性細菌集団を減少させる (消毒する) のに最も効果的であることが判明し、ECAS は定着細菌の密度を減少させるのに最も効果的であることが判明しました。バイオフィルム。 浮遊性大腸菌集団の消毒と緑膿菌バイオフィルム密度の低減との間の、OCl-、HOCl、および ECAS の有効性の直接比較は、注意して実行する必要があることに注目する価値があります。 プランクトン性緑膿菌は日和見病原体であるとの見方から、標準的な飲料水分析の一部として含まれていないため、消毒は行われませんでした。 逆に、大腸菌バイオフィルム密度の減少の調査は、緑膿菌とは異なり、バイオフィルムを形成することがよく知られていないため、行われなかった。 HOCl および ECAS と有機物 (フミン酸など) との相互作用は、OCl-8 とは異なり、高濃度の消毒副生成物、特にトリハロメタンの生成をもたらさないことが以前に実証されています。濾過や凝固による物質の除去は一般的な方法ではなく、可能ではありませんが、HOCl または ECAS の導入は、給水中の微生物負荷を効果的に削減し、バイオフィルム形成の管理に役立つだけでなく、THM の形成を最小限に抑え、生物学的および化学的な物質の生成を保証します。安全な飲料水。 ただし、HOCl は (この研究で示されているように) NaDCC の溶解を通じて化学的に生成できますが、電気化学的に生成することもできます 62。 効果的な消毒剤をその場で必要に応じて生産できるため、危険な化学物質の輸送と保管の必要性が最小限に抑えられ、環境への化学物質の偶発的な放出の可能性が減少します。 電気化学的に生成された HOCl (酸性または弱酸性) の準安定な性質により、化学的に緩和されて元の食塩水に戻るため、有機物質にさらすことで過剰な溶液を簡単に不活性化できます 19。 電気化学的に生成された HOCl は、食品生産 16,22 や医療現場 19 を含む幅広い環境で有効であることが証明されており、他の消毒では不可能な POU 飲料水処理用途だけでなく、1 つの消毒剤を地域社会全体で安全に使用できるようになります。 UV、オゾン、粒状活性炭などの技術。 電気化学的に生成された HOCl は、抗バイオフィルム活性の向上とともに優れた抗菌活性を提供する可能性があります (POU 飲料水処理インフラ内での重要な考慮事項) が、POU 用途でのその使用にはさらなる調査が必要です。 この研究の限界は、残留遊離塩素濃度が殺菌またはバイオフィルム減少アッセイ後にモニタリングされていないことである。 POU 飲料水処理システム中の遊離濃度が WHO の要求濃度 (0.2 ～ 0.5 mg L-1) を超えないようにするため、将来の研究では殺菌またはバイオフィルム削減アッセイ後の残留塩素濃度を監視する予定です。

この研究は、POU 飲料水用途の塩素ベースの消毒剤についての理解を進めるのに役立ちました。 しかし、POU システムに供給される原水は、特に環境内の単一種のコミュニティに細菌が存在することはほとんどないことを考慮すると、さまざまな有機物質と多数の微生物種が存在し、ここでテストしたものよりもはるかに複雑です63。 したがって、代表的なモデルシステムの一部として、より複雑なマトリックス内で複数種の培養物/バイオフィルムを調査することは、抗菌活性と、POU 飲料水処理での用途についてテストされた消毒剤の適合性についての理解をさらに進めるために必要です。 このようなモデルでは、バイオフィルム形成に影響を与える可能性のあるさまざまな POU 飲料水処理システム (配管やフィルターなど) を表すさまざまな材料表面をテストする必要があります。

この研究では、NaOCl、中性の弱酸性 HOCl、および電気化学的に生成された酸性 HOCl の 3 つの消毒剤が使用されました。 NaOCl に存在する主な塩素種は OCl- でしたが、中性および酸性の HOCl 溶液の両方では HOCl が主でした。 電気化学的に生成された酸性ＨＯＣｌは、電気化学的に活性化された溶液［ＥＣＡＳ］と呼ばれる。 NaOCl の原液は、市販の漂白剤 (パターソンズ漂白剤、パターソンズ社、英国ブリストル) を脱イオン水で最終遊離塩素 [FC] 濃度 508 ± 18.19 mg L-1、平均 pH 11.4 になるまで希釈することによって調製しました。 ± 0.1、平均 ORP は +588 ± 0.95 mV でした。 弱酸性 HOCl ストック溶液は、1 リットルの脱イオン水内で NaDCC を溶解することによって調製され、FC 濃度 201 ± 13.55 mg L-1、pH 5.6 ± 0.25、平均 ORP +958 ± 18.98 mV が得られました。 ECAS は、Bridge Biotechnology Ltd (ファイフ、スコットランド、英国) が供給する 60 L/h 電気化学発生装置を使用した NaCl 溶液の電気分解によって生成されました。 FC 濃度 158.63 ± 18.66 mg L-1、平均 pH 3.3 ± 0.16、ORP +1134 ± 3.26 mV の ECAS 溶液を生成し、暗所で 4 °C で保存し、生成後 5 日以内に使用しました。 すべての消毒剤溶液は脱イオン水を使用して希釈され、N,N-ジエチル-p-フェニレンジアミン硫酸塩 (DPD) 番号 2 によって決定される標準化された同等の FC 濃度が得られました。 1 Palintest テスト (Palintest Ltd.、ゲーツヘッド、英国)。 溶液のｐＨおよびＯＲＰは、Ｏｒｉｏｎ Ｄｕａｌ Ｓｔａｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を使用して測定した。

大腸菌 ATCC 10536 および緑膿菌 ATCC 15422 を、-80 °C で保存した凍結ストックから回収したトリプトン大豆寒天 (TSA [Oxoid, Thermo Scientific, UK]) 上で 37 °C で 24 時間増殖させました。

大腸菌に対する NaOCl、HOCl、および ECAS の殺菌活性を測定するための標準懸濁液アッセイは、BS EN 1040 (41British Standards Institution、2005) および BS EN 1276 (42British Standards Institution、2009) に従って実行されました。 25、50、100、および 150 mg L-1 の標準化された FC 濃度を、各試験消毒剤の治療計画として使用しました (セクション 4.1 を参照)。

BS EN 1040/1276 標準アッセイに従って、希釈溶液 (1 g L-1 トリプトンおよび 8.5 g L-1 NaCl) 内の大腸菌の細菌懸濁液は、光学密度 (OD620nm) によって 8.54 ± 0.27 log10 CFU mL- に標準化されました。 1. 必要に応じて、0.3 g 100 mL-1 (きれいな) BSA と 3.0 g 100 mL-1 (汚れた) BSA を溶解することによって、2 つの濃度の (BSA) の阻害溶液を調製し、その後、0.45 μm シリンジフィルター (Sartorius Minisart® シリンジ) で濾過滅菌しました。フィルター）。 これにより、最終アッセイ BSA 濃度は 0.3 g L-1 (クリーン) および 3.0 g L-1 (ダーティ) となりました。

アッセイは、指定された接触時間、1 mL の大腸菌試験懸濁液を 1 mL の阻害溶液 (滅菌 DI、清潔または汚れた BSA) および 8 mL の試験消毒剤 (NaOCl、HOCl または ECAS) と混合することによって実行されました。 20℃で5分間。 続いて、反応バイアルからの 1 mL サンプル (試験懸濁液、阻害溶液、および試験消毒剤で構成される) をピペットで直ちに 9 mL の検証済み中和溶液 (5 g L-1 チオ硫酸ナトリウムおよび 27.5 g L-1 Letheen Broth; BD ディフコ、ベクトン ディキンソン）。 中和したサンプルを滅菌 DI で段階希釈し、Whitley Automated Spiral Plater ([WASP] Don Whitley Scientific、Shipley、UK) を使用して TSA (50 μL 容量) 上に二重にプレーティングしました。 次に、これらを 37 °C で 24 時間インキュベートし、得られたコロニーを計数しました (mL あたりの CFU として表します)。

疾病管理センター [CDC] バイオフィルム リアクター (図 5 を参照);64 は、PC クーポン (BioSurfaces Technologies、米国) 上で緑膿菌バイオフィルムの増殖とテストに使用されました。 5、25、50、75、100、および 150 mg L-1 の標準化 FC 濃度を、各試験消毒剤の治療計画として使用しました (セクション 2.1 を参照)。

CDCバイオフィルムリアクターの標準的な実験装置。 滅菌投入培地 (トリプトン大豆ブロスなど) は 20 L Nalgene™ カーボイ [1] 内に保持され、単一チャネルの蠕動ポンプ [2] を通して CDC バイオフィルム リアクター [3] に向かって吸引されます。 加熱撹拌プレート[4]は、CDC 反応器内の温度とせん断力を一定に維持しました。 無菌の Nalgene™ 廃棄物カーボーイが CDC バイオフィルム反応器の廃棄物を収集します [5]。

緑膿菌接種材料を、振盪インキュベーター内で 100 mg L-1 トリプトン大豆ブロス (TSB [CM0129; Oxoid, Thermo Scientific, UK]) 100 mL 中で 35 °C、150 rpm で 24 時間培養し、最終微生物密度は 7.79 ± 0.17 log10 CFU mL−1 (n = 9)。 滅菌培地 (TSB 100 mg L-1 330 mL) を、ロッドあたり 3 個の PC クーポンを収容するクーポン ロッドを含む滅菌 CDC リアクターに加えました (リアクターあたり n = 8 ロッド)。 CDC リアクターを加熱した撹拌プレート (22.5 °C に設定し、125 rpm で継続的に撹拌) 上に置き、1 mL の緑膿菌接種材料を加えて 24 時間インキュベートし (バッチ段階)、細菌を付着させて定着させました。 PC クーポン上のバイオフィルム (除去ロッド内に含まれています)。 続いて、オートクレーブ可能な滅菌 20 L カーボイ (Nalgene™ 2250-0050; Fisher Scientific、英国) から採取した滅菌培地 (100 mg L-1 TSB) を 11 mL の流量で CDC リアクターに連続的に導入しました。 min−1、さらに 24 時間。 この期間中の CDC 反応器内の容積は、廃媒体カーボイに接続されたオーバーフロー堰によって維持されました。 この方法により、8.45 ± 0.172 log10 CFU クーポン -1 (n = 18) の密度で再現可能な緑膿菌 PC クーポン バイオフィルムが得られたため、その後の実験に適しています。

試験消毒剤の抗菌活性の評価を可能にするために、緑膿菌 PC クーポン バイオフィルムを CDC リアクターから無菌的に取り出し、3 mL の試験消毒剤または滅菌 DI (対照) を含む 50 mL ファルコン チューブに入れました。 室温で 5 分間接触させた後、27 mL の検証済み中和溶液 (5 g L-1 チオ硫酸ナトリウムおよび 27.5 g L-1 Letheen Broth) をすべてのサンプルに添加し、室温でさらに 10 分間放置しました。 続いて、PC クーポンの表面からバイオフィルムを除去するために、各ファルコン チューブを 30 秒間ボルテックスし、超音波処理水浴 (FB11078 FisherBrand) に 1 分間置き、これを合計 3 回繰り返しました。 脱凝集したバイオフィルム細胞を 4 分の 1 強度のリンガー液 (Oxoid、Fisher Scientific、英国) で連続希釈し、R2A 寒天 (Oxoid、Thermo Scientific、英国) 上にスパイラルプレーティングしました。 プレートを37℃で24時間インキュベートし、得られたコロニーを計数し、クーポンあたりのCFUとして表しました。

CT 値は、消毒剤 (遊離活性塩素など) の濃度と消毒される水との接触時間の積です。 CT 値は、室温 (2020 –22.5 °C)、mg/min L-1 で表されるように調整されています。

殺菌アッセイおよびバイオフィルムアッセイのデータセットの両方について、Tukey の事後検定による二元配置分散分析 (ANOVA) を使用して、消毒剤の種類と FC 濃度の間の有意差を決定しました (Windows 用 GraphPad Prism バージョン 7.0、カリフォルニア州サンディエゴ) 。 < 0.05 の AP 値を有意であるとみなしました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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この研究は、英国自然環境研究評議会 [NE/R003106/1]、西イングランド大学ブリストル校、およびポーツマス航空株式会社の資金提供を受けました。

生物科学研究センター、西イングランド大学、ブリストル、BS16 1QY、英国

ジリアン・E・クレイトン、ロビン・MS・ソーン、ダレン・M・レイノルズ

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GEC: 実験方法の開発、実験作業、データ収集と分析、原稿の準備と執筆、レビューと編集。 RMST: 資金の獲得、実験の概念化と開発、プロジェクトの監督、原稿のレビューと編集。 DMR: 資金調達、実験の概念化と開発、プロジェクトの監督、原稿のレビューと編集。

ダレン・M・レイノルズへの通信。

著者らは、潜在的な利益相反とみなされる可能性のある商業的または金銭的関係が存在しない状態で研究が実施されたことを宣言します。

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転載と許可

ジョージア州クレイトン、RMS ソーンおよびDM レイノルズ 分散型使用時点飲料水の浮遊細菌およびバイオフィルム細菌に対する塩素系消毒剤の有効性。 npj クリーン ウォーター 4、48 (2021)。 https://doi.org/10.1038/s41545-021-00139-w

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受信日: 2021 年 7 月 9 日

受理日: 2021 年 10 月 8 日

公開日: 2021 年 11 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41545-021-00139-w

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