vBの抗菌作用

Jul 02, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7470 (2023) この記事を引用

865 アクセス

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ファージ溶解酵素は、有望な抗菌剤です。 この研究では、vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) に由来するエンドリシンが同定されました。 このエンドリシンは、保存されたリゾチームドメインを表していました。 組換えエンドリシン (lysAB-vT2) および疎水性融合エンドリシン (lysAB-vT2-fusion) を発現および精製しました。 両方のエンドリシンは、グラム陰性細菌の細菌粗細胞壁に対して溶解活性を示しました。 lysAB-vT2融合体のMICは2mg/mlで、100μMに相当するが、lysAB-vT2のMICは10mg/ml(400μM)を超えた。 lysAB-vT2融合とコリスチン、ポリミキシンBまたは銅との組み合わせは、A.バウマニに対して相乗効果を示した（FICI値は0.25）。 分別阻害濃度（FIC）でのlysAB-vT2融合体とコリスチンの抗菌活性は、大腸菌、肺炎桿菌、および高度薬剤耐性A.バウマンニ（XDRAB）およびファージ耐性A.バウマンニの様々な株を阻害できることが明らかになった。 lysAB-vT2-融合体は、酵素を 4、20、40、および 60 °C で 30 分間インキュベートした後でも抗菌活性を保持していました。 lysAB-vT2融合体は成熟バイオフィルムを阻害することができ、A.バウマニに感染したT24ヒト細胞とlysAB-vT2融合体をインキュベートすると、T24細胞からのLDH放出が部分的に減少した。 要約すると、我々の研究は、A. baumannii 感染の制御に応用できる、改変された lysAB-vT2 融合エンドリシンの抗菌能力を強調しています。

アシネトバクター・バウマニは、院内感染の主な原因として浮上しているグラム陰性細菌であり、長期入院で人工呼吸器を使用している患者にとって特に問題となる。 最後の手段である抗生物質コリスチンによる治療に抵抗する万能薬剤耐性A.バウマニの発生率の増加との関連性が、新規抗菌剤の研究を加速させている。 潜在的な候補の 1 つは、抗生物質に耐性のある細菌感染症を治療するために溶解性バクテリオファージまたはファージ酵素を使用するファージ療法です 1,2。 ただし、ファージビリオンの使用には、狭い宿主範囲に対するファージ特異性や耐性発現の可能性などの制限があります3。 我々の以前の研究では、タイで分離された A. バウマンニの 50% が、試験した 17 個の溶解性 A. バウマンニ ファージに対するファージ耐性株であることが示されました4。 したがって、ファージビリオンの使用と比較して、抗菌剤としてバクテリオファージ溶解酵素、つまりエンドリシンを使用することへの関心が高まっています。 エンドリシンは、ペプチドグリカン層を加水分解することによって機能するファージ酵素であり、その結果、膨圧の突然の低下と浸透圧溶解が起こり、細菌細胞死を引き起こします5。 さまざまな A. baumannii ファージからの組換えエンドリシンがクローン化され、発現され、特性評価されています 6、7、8、9、10、11、12、13、14。 ユアンら。 そしてキムら。 は、エンドリシン、Abtn-4 および LysSS が、いくつかのグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対して広範な抗菌活性を示すことを示しました。 さらに、エンドリシン LysAB3、Abtn-4、および Abp013 が A. baumannii バイオフィルムの減少に効果的であることが観察されました 9,13,14。 LysABP-01、ABgp46、LysMK34、ElyA1 などのエンドリシンの活性は、有機酸 7 やコリスチン 8、10、11 などの外膜透過剤と組み合わせることで増強できます。 さらに、改変されたエンドリシンは、コリスチン耐性 A. バウマンニ株に対する抗菌活性を向上させることが示されています 15。

以前の研究で、我々はその宿主およびさまざまな A. baumannii 株に対して最高の有効性を示した vB_AbaM_PhT2 を同定しました。 このバクテリオファージはコリスチンとの相乗作用も示しました16。 vB_AbaM_PhT2 のゲノム解析は、Next Generation Sequencing (NGS) を使用して行われ、リシンをコードする推定遺伝子の同定が可能になりました。 これらの酵素は細菌の細胞壁にあるペプチドグリカンを加水分解するため、抗生物質の代替品として有力な候補となります。 A. baumannii の多くのエンドリシンは特徴付けられていますが、疎水性アミノ酸融合エンドリシンの役割に関する研究はほとんどありません。 大腸菌エンドリシンの溶解能力は、エンドリシンの C 末端に疎水性アミノ酸を付加することによって強化されました 17。 したがって、我々は、組換えファージエンドリシンおよび疎水性融合エンドリシンの抗菌活性と、それらの抗生物質、消毒剤、重金属およびファージとの潜在的な相乗効果を調査することを目的とした。 融合エンドリシンは、天然酵素と比較して高い溶解活性を示しました。 タイの融合エンドリシンのさまざまな病院から分離された A. baumannii のさまざまな株に対する細胞毒性アッセイ、バイオフィルム形成阻害および抗菌活性が調査されました。

ファージ vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) のゲノムを調査し、エンドリシン遺伝子を同定しました。 エンドリシンはファージ vPhT2 のゲノムで検出されました (QHJ75684.1)。 lysAB-vT2は187アミノ酸残基を含むが、lysAB-vT2融合体は199アミノ酸残基を含む(図1A)。 リゾチームの保存ドメインがアミノ酸 65 ～ 180 で検出されました (図 1A)。 vPhT2 エンドリシン遺伝子の配列は、ファージ RL_2015 (アクセッション番号 AJG41873.1) およびファージ AM24 (アクセッション番号 APD20282.1) のエンドリシン遺伝子と 53.53 ～ 60.54% の配列同一性を示します (図 1B)。 lysAB-vT2のアミノ酸配列と、ファージRL_2015およびファージAM24由来のエンドリシンとの比較を図1Cに示した。

エンドリシン LysVTh2 (lysAB-vT2) の特性評価とバイオインフォマティクス分析。 (A) 推定上のエンドリシン (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合-LysVTh2 (lysAB-vT2-融合) の保存ドメインの概略図。 この図は、Pfam Web サーバーを使用して予測されました。 (B) LysVTh2 (lysAB-vT2) と以前に報告された 16 個の A. baumannii ライシン間の系統関係を示すブートストラップ コンセンサス ツリー。 進化の歴史は、1,000 回のブートストラップ複製による近隣結合法を使用して推定され、MEGA 11 で実行されました。 (C) vB_AbaM_PhT2 (LysVTh2、lysAB-vT2)、AM24 (Accession no. APD20282.1)、および RL-2015 の比較分析(アクセッション番号 AJG41873.1)Clustal Omega アルゴリズムによる複数配列比較を使用したエンドリシン。

lysAB-vT2 および lysAB-vT2-fusion は両方とも可溶型で発現されました。 精製された組換えタンパク質の収量はどちらも、培養物 1 リットルあたり 5.16 mg および 4.44 mg でした。 精製されたタンパク質を SDS-PAGE で検査したところ、約 25 kDa のバンドが観察されました。これは、予測分子量 25 kDa に相当します (図 2)。

エンドリシン (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合 LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) のタンパク質発現解析およびプレート溶解アッセイ。 (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) の発現と精製に関する SDS-PAGE 分析。 レーン M、BLUeye 染色済みタンパク質ラダー。 レーン 1、非誘導細菌溶解物。 レーン 2、IPTG 誘導細菌溶解物。 レーン 3、透析後の精製エンドリシン (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合 LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion)。

組換えタンパク質をプレートスポットアッセイで利用して、細菌粗細胞に対する両方のエンドリシンの溶解活性を測定しました。 結果は、両方のタンパク質が A. baumannii 株 ATCC 19606、MDRAB および XDRAB 株に対して溶解活性を有することを示しました (図 3)。 これらは、大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌などの他のグラム陰性粗細胞に対しても溶解活性を示します (図 3)。 しかし、グラム陽性菌株である黄色ブドウ球菌では溶解活性は検出されなかった。 精製融合-LysVTh2の阻害ゾーンは、精製LysVTh2および卵白リゾチームよりも大きかった（表S1）。

A. baumannii に対する精製エンドリシン (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合 LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) のプレート溶解アッセイ。 A. バウマンニに対する精製エンドリシン (LysVTh2、lysAB-vT2) および融合 LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) のプレート溶解アッセイは、オートクレーブ処理した A. バウマンニ ATCC 19606、A. バウマンニ AB003 (MDRAB)、 Ａ．バウマニ ＡＢ３２９（ＸＤＲＡＢ）、Ｐｓ． 緑膿菌 ATCC 27853、大腸菌 ATCC 25922、肺炎桿菌 ATCC 27736、および黄色ブドウ球菌 ATCC 6538。卵白リゾチーム (EWL) を陽性対照として使用しました。

MIC を測定することによって 2 つの組換えエンドリシンの有効性を比較しました。 精製されたlysAB-vT2またはlysAB-vT2融合体のMICを、A.バウマンニATCC19606の生細胞の増殖を阻害する能力について細菌増殖阻害アッセイを使用して試験した。結果は、lysAB-vT2融合体のMICが、 2 mg/ml は 100 μM に相当しますが、lysAB-vT2 の MIC は 10 mg/ml (400 μM) を超えていました。

我々は、抗生物質、消毒剤、重金属およびバクテリオファージ vPhT2 と組み合わせた lysAB-vT2 融合の効果を評価しました。 テストされたすべてのエージェントの MIC を表 S2 に示します。 lysAB-vT2-融合の相乗効果は、2 つの薬剤の MIC の 0.25 倍での増殖阻害アッセイによってスクリーニングされました。 図4Aに示すように、両方のエンドリシンとコリスチンおよびポリミキシンBの組み合わせは抗菌活性の上昇を示し、続いてCuCl2が抗菌活性を示し、阻害率はそれぞれ95.8、73.1、および31.5％でした（表S3）。 EDTA (16.3%)、ZnCl2 (7.4%)、第四級アンモニウム化合物 (7.3%)、およびイミペネム (5.9%) と lysAB-vT2 融合体との低い相互作用が観察されました (表 S3)。 lysAB-vT2-融合をクロロキシレノール、次亜塩素酸ナトリウム、およびバクテリオファージvPhT2と組み合わせた場合、相互作用はありませんでした。 コリスチン、ポリミキシン B、および CuCl2 の抗生物質相乗効果を測定するチェッカーボード アッセイを実行しました。 lysAB-vT2融合とコリスチンとの組み合わせの分別阻害濃度(FIC)は9.76および0.5μg/ml、ポリミキシンBは11.71および0.5μg/ml、CuCl2は10.15μg/mlおよび1.62mMであった(図4B)。 ）。 lysAB-vT2-融合および3つの薬剤すべてのFICインデックスは0.25と計算され、これは相乗作用を示している(図4B)。

相乗効果のスクリーニングおよび確認試験、およびチェッカーボード分析による相乗効果の測定。 (A) 3 つの抗生物質 (イミペネム、コリスチン、ポリミキシン B)、3 つの消毒剤 (第 4 級アンモニウム化合物、クロロキシレノール、次亜塩素酸ナトリウム)、2 つの重金属 (ZnCl2、CuCl2) との lysAB-vT2 融合体の増殖阻害率 (棒グラフ) ）、およびバクテリオファージ vPhT2。 データは、3 回の実験の平均パーセンテージ ± SD として表されます。 (B) コリスチン、CuCl2、およびポリミキシン B との lysAB-vT2 融合のチェッカーボード アッセイ。

lysAB-vT2-融合の抗菌力を評価するために、lysAB-vT2-融合単独およびコリスチンと組み合わせたlysAB-vT2-融合の抗菌活性を、A.バウマンニのさまざまな菌株および他の細菌種に対して測定しました（表S4）。 試験した27株のA.バウマニ株のうち、14株が2mg/mlの酵素で阻害され、阻害率は85％を超えました（図4Bおよび表S5）。 われわれは、lysAB-vT2-融合とコリスチンの抗菌活性が増加し、大腸菌ATCC 25922、肺炎桿菌ATCC 27736、ファージ耐性A. バウマンニMDRAB、XDRABおよびNR株を阻害できることを発見した。 さらに、コリスチンと組み合わせると、この酵素は 26 株のうち 22 株の A. baumannii 株の増殖を 90% 以上阻害できます (表 S6)。 酵素単独またはコリスチンとの酵素は、コリスチン耐性A. baumanniiの低い阻害を示した(図5)。

lysAB-vT2-融合およびlysAB-vT2-融合とコリスチン、ポリマイシンB、およびCuCl2の抗菌活性。 lysAB-vT2-融合体（2mg/ml）（黒色のバー）、lysAB-vT2-融合体とコリスチン（10μg/ml + 0.5μg/ml）（緑色のバー）、lysAB-vT2-融合体とポリミキシンBの抗菌活性(10 ug/ml + 0.5 ug/ml) (青色のバー)、およびlysAB-vT2-fusion + CuCl2 (10 ug/ml/1.62 mM) (赤色のバー) は、大腸菌、緑膿菌に対する阻害アッセイを使用して測定されました。 、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの様々な株。

lysAB-vT2-fusion の抗菌活性の耐熱性を分析するために、熱安定性試験を実行しました。 我々のデータは、lysAB-vT2-融合体が抗菌活性を保持し、20℃でのインキュベーション後、ほぼ95%の阻害率を示した。 酵素を4、20、40、および60℃でインキュベートした後のlysAB-vT2融合の結果は、阻害率がほぼ75%であることを示しました。 80℃では、lysAB-vT2融合の阻害率は30%に低下しました（図6）。 タンパク質濃度の減少率は、4、20、および 40 °C では低かった。 タンパク質濃度の減少率は、80 °C で 80% に減少することがわかりました (図 6)。

lysAB-vT2-融合体の熱安定性。 lysAB-vT2-融合体の抗菌活性の熱安定性は、4、20、40、60、および80℃で20分間インキュベートした後、2 mg/mlのlysAB-vT2-融合体を用いた細菌阻害アッセイを使用して決定されました。 黒いバーは熱処理後の酵素の阻害パーセントを表し、灰色のバーはタンパク質濃度の減少パーセントを表します。

lysAB-vT2-融合の可能性のある使用を評価するために、lysAB-vT2-融合の細菌バイオフィルム破壊および細胞毒性を測定した。 バイオフィルムアッセイでは、4 mg/ml lysAB-vT2 融合体および 1 × 108 PFU/ml のファージ vPhT2 を 72 時間 A. baumannii バイオフィルムに曝露すると、バイオフィルムに残存する CFU が大幅に減少することがわかりました。 酵素濃度が 4 mg/ml 未満では、バイオフィルムの形成が増加しました (図 7A)。

バイオフィルム、およびlysAB-vT2-融合の細胞毒性。 (A) MBEC アッセイは、lysAB-vT2-融合の濃度を変化させることによる成熟 A. バウマンニ AB183 バイオフィルムの破壊を定量化しました。 A. バウマンニ AB183 のバイオフィルムを 96 ウェル MBEC プレート上で 3 日間かけて形成し、バイオフィルム細胞のみを測定するエンドリシンの希釈液を使用したその後の 24 時間処理により、エンドリシンを介したバイオフィルム細菌の死滅を定量しました。 (B) 成熟 A. バウマンニ AB183 バイオフィルムに対する、バクテリオファージ vPhT2 (Φ2) の同時および時間差処理 (24 時間後) による lysAB-vT2 融合体 (2 mg/ml) のアジュバント効果 * アスタリスクは P ≤ 0.05 を示します *** アスタリスクはP ≤ 0.001。

A.バウマンニバイオフィルムの除去におけるファージvPhT2とのlysAB-vT2融合エンドリシンのアジュバント効果を評価するために、同時および逐次曝露によって治療を実施し、評価した。 我々のデータは、エンドリシンを24時間処理し、その後ファージvPhT2をさらに24時間処理しても、バイオフィルム中のCFUの数が有意に減少しなかったことを示している(図7B)。 ただし、成熟アシネトバクター バイオフィルムを lysAB-vT2 融合体 (2 mg/ml) とファージ vPhT2 (1 × 108 PFU/ml) で同時に処理すると、バイオフィルムに残留する CFU が大幅に低下し (p < 0.05)、同時処理が示唆されます。エンドリシンとファージの治療は、時間差で行うよりも優れています。

細胞毒性アッセイでは、基礎 LDH 活性は約 40% と比較的高いようでした。 LysAB-vT2融合単独では、基礎条件と比較して、T24ヒト細胞からのLDH放出が約10%増加するようであった。 これは、未治療群と比較した統計的有意差として返されました (*; p < 0.05)。 lysAB-vT2 融合体と AB183 に感染した T24 ヒト細胞との共インキュベーションにより、T24 からの LDH 放出が部分的に減少しました (AB183 と空のビヒクルを添加した細胞と比較して約 15% 減少)。これは、エンドリシンが2 mg/ml の濃度で AB183 を不活化しましたが、相対的な細胞毒性レベルは高いままでした (約 75%) (図 8A)。

ヒト上皮細胞に対するエンドリシン（融合-LysVTh2）の細胞毒性。 AB183 を Leibovitz 培地で一晩増殖させ、細胞を 1 時間感染させるために使用した後、2 mg/ml の lysAB-vT2 融合体を関連サンプルに添加し、さらに 23 時間インキュベートしました。 次に、Invitrogen CyQUANT キットを使用して LDH 細胞毒性アッセイを実行しました。 (A) A. バウマンニ AB183 に感染した T24 ヒト上皮細胞の lysAB-vT2 融合処理の回復と細胞毒性。 (B) lysAB-vT2融合エンドリシンと抗菌剤の同時処理後のAB183感染からのT24ヒト上皮細胞の回復後の細胞毒性。 CuCl2 (1.62 mM) および硫酸コリスチン (0.5 μg/ml)。

他の抗菌剤とのエンドリシンの使用の可能性、lysAB-vT2融合体および抗菌剤：塩化銅（CuCl2）および硫酸コリスチンによる感染および非感染ヒト上皮細胞の同時処理の細胞毒性を評価する。 lysAB-vT2 (2 mg/ml) および塩化銅 (1.62 mM) による AB183 感染および非感染 T24 ヒト上皮細胞の処理では、未処理/非感染コントロールと比較して LDH 放出に有意な差は生じませんでした。 T24 細胞を lysAB-vT2 融合体 (2 mg/ml) および硫酸コリスチン (0.5 μg/ml) に曝露した場合にも同様のことが見られ、自然放出対照と比較して T24 細胞に対する細胞毒性に差はありませんでした。 T24 細胞の AB183 感染も、すべての抗菌治療の組み合わせで首尾よく治療されました (図 8B)。

エンドリシンなどのバクテリオファージ由来の酵素は、多剤耐性細菌の出現に対抗するために研究されてきました。 この研究では、vPhT2 のエンドリシンタンパク質を調査しました。

エンドリシンの多様性は、特定のペプチドグリカン結合の切断に関与する酵素触媒ドメイン (ECD) と、細菌の細胞壁上の特定のエピトープの認識に関与する細胞結合ドメイン (CBD) に依存します 18。 細胞壁結合ドメイン (CBD) を持つエンドリシンは、N 末端にペプチドグリカン結合ドメイン PG3 を含むエンドリシン ElyA1 および ElyA2 である一部の A. バウマンニ バクテリオファージでのみ同定されています (11)。 lysAB-vT2のBLAST分析により、1つのECDとリゾチーム保存ドメインが予測されましたが、CBDはこのエンドリシンには存在しませんでした（図1A）。 エンドリシン lysAB-vT2 の ECD は、N-アセチルムラミン酸と N-アセチルグルコサミンの間の β-1,4-グリコシド結合を切断するムラミダーゼ (N-アセチル-β-D-ムラミダーゼ) であり、これは以前の報告と一致していました 7。 8. lysAB-vT2 と他の A. baumannii 溶解素との系統関係研究では、これが未分類のファージ RL_2015 および 2014 年に単離されたファージ AM24 のエンドリシンと密接に関連していることが示されました (モスクワ、ロシア)19。

2 つの組換えエンドリシンが発現および精製されました。 以前の報告と一致して、我々は両方のエンドリシンがグラム陰性菌のオートクレーブされた細胞を溶解するボードスペクトルを示すことを発見しました8。 天然のlysAB-vT2のMICは10 mg/mlより高かった。 天然の lysAB-vT2 には CBD が欠如しているため、天然のエンドリシンはグラム陰性菌のペリプラズム空間にある内部ペプチドグリカン層を通過して到達することができません 17。 さらに、vPhT2 のゲノム内にホリン溶解メディエーター (GenBank: QHJ75701.1) を発見しました。 ホーリンはファージにコードされた膜タンパク質であり、ファージにコードされたエンドリシンのペプチドグリカンへのアクセスを制御し、それによって溶解プロセスを引き起こします。 グラム陰性菌溶解素の物理化学的特性（正味電荷、疎水性、疎水性モーメント、脂肪族指数など）は、グラム陰性菌エンベロープとの相互作用の改善に関与しています20。 したがって、疎水性ポリペプチドが外膜の透過を可能にしているため、我々はlysAB-vT2のエンドリシンとの疎水性アミノ酸融合を生成した21。 天然の lysAB-vT2 と比較して、lysAB-vT2-fusion の MIC は 5 分の 1 に減少しており、我々は lysAB-vT2-fusion の活性に注目しました。 Anikin らの報告によると、lysAB-vT2 融合体の C 末端の脂質部分は、その脂質部分を介して抗生物質を細菌の膜に固定するのに役立ちました 22。

A. バウマンニや緑膿菌などの多剤耐性細菌の臨床株に対するコリスチンとエンドリシンの組み合わせは、in vitro および in vivo で報告されています 8,11。 私たちの研究では、lysAB-vT2-融合間の相互作用により、コリスチン、ポリミキシンB、およびCuCl2との抗菌活性が上昇することがわかりました。 コリスチンとポリミキシン B は正に帯電した抗生物質で、リピド A の負に帯電したリン酸基とその疎水性末端アシル脂肪鎖を介して結合し、外部外膜 (OM) の拡張を引き起こします23。 OM の透過化が起こり、エンドリシンが OM を通過してペプチドグリカン層の加水分解を切断できるようになります。 lysAB-vT2-融合とイミペネムの組み合わせでは、両薬剤の 0.25 × MIC レベルで差はありませんでした。 カルバペネム系のベータラクタム系抗生物質であるイミペネムは、ペニシリン結合タンパク質 (PBP) を不活性化することによって作用します。 サブMICレベルでは、構造的障壁として細菌の外膜が存在するため、両方の薬剤のペプチドグリカンへのアクセスが制限されます。 さらに、銅 (Cu+) イオンは農業や医療分野で抗菌剤として使用されています。 MIC 未満のレベルでは、銅表面に曝露された細胞は膜損傷 24 を誘発し、エンドリシンが OM を通過して酵素の抗菌活性を高めることができます。 lysAB-vT2-融合とコリスチンは、XDRAB、MDRABなどのA.バウマンニのさまざまな株の増殖を阻害できますが、コリスチン耐性A.バウマニ（COLRAB）の増殖は阻害しません。 この現象は、この研究における COLRAB の MIC が 32 μg/ml であり、酵素と組み合わせて低濃度のコリスチン (0.5 μg/ml) が使用されたという事実によって説明できますが、この濃度は外部の細胞を破壊するのに十分ではない可能性があります。コリスチン耐性株の外膜（OM）は、酵素の機能を妨げます。

lysAB-vT2-融合を臨床環境における抗菌製品として適用するために、lysAB-vT2-融合の熱安定性、バイオフィルムアッセイおよび細胞毒性が測定された。 熱安定性テストでは、エンドリシンが 4 ～ 60 °C の広い温度範囲でも機能することが示されました。 ただし、80 °C では、タンパク質の変性により、lysAB-vT2 融合の阻害率が低下しました。 以前の報告と一致して、lysAB-vT2-融合はバイオフィルムの形成を阻害し、成熟したバイオフィルムを減少させることができます10、25、26。 私たちの研究では、4 mg/ml のエンドリシンとファージ vPhT2 が成熟バイオフィルムを阻害できることがわかりました。 MBEC 濃度は MIC レベルより高かった。 この現象は、細胞外高分子物質 (EPS) マトリックス 26 に包まれ、高い MBEC に寄与するバイオフィルムの構造によって説明できます。 lysAB-vT2融合は、A.バウマンニバイオフィルムの破壊においてファージ療法と併用して効果的に使用できることが判明した。 時間をずらした抗菌ファージ療法がより効果的であるという文献の発見とは対照的に、ファージとlysAB-vT2融合エンドリシンの両方を同時に使用する同時治療は、バイオフィルムの破壊において逐次治療よりも効果的であることが判明した27。 この現象は、従来の抗菌薬とは異なり、ファージのエンドリシンがバイオフィルム内のファージのライフサイクルを妨げないためと説明されるかもしれません。

以前の報告に反して、A. baumannii のファージおよびファージ酵素は安全であり、他の抗菌薬と組み合わせて使用​​した場合でも、ヒト細胞株に対して細胞毒性を示さないことが判明しました 12,16。 私たちの研究では、エンドリシンが A. baumannii を不活化して細胞毒性を引き起こすことができるが、相対的な細胞毒性レベルは依然として高いことが判明しました。 これは、以前の研究と比較して高濃度の酵素が使用されたという事実によるものです。

結論として、我々はファージの疎水性アミノ酸融合エンドリシン、lysAB-vT2-fusionをクローニングし、発現させました。 この酵素は抗菌活性があり、成熟したバイオフィルムを減少させる能力があり、コリスチンとの相乗効果があります。 この酵素は、コリスチンと組み合わせて、または単独で、MDRAB、XDRAB、ファージ耐性 A. バウマンニなどのさまざまな株の A. バウマンニを阻害できます。

バクテリオファージ vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) は、前述のように単離および特性評価されました 10。 抗菌活性を試験するために、2006年から2021年にタイの5つの病院から収集されたA.バウマニ分離株と、2021年にナレスアン大学病院の病院環境から分離されたA.バウマニ分離株を使用しました（表S1）。 A. バウマニの株は、薬剤感受性の A. バウマニ (NR)、多剤耐性の A. バウマニ (MDRAB)、極度の薬剤耐性の A. バウマニ (XDRAB)、カルバペネム耐性の A. バウマニ (CRAB)、コリスチン耐性の A. バウマニでした。 .バウマンニ（COLRAB）、および以前の研究からのファージ耐性A.バウマンニ株（PRAB）28。 すべての分離株の抗生物質感受性は CLSI 201729 に従って決定され、表 S1 に示されています。 A. baumannii 株は、Luria-Bertani (LB) ブロスまたは寒天で増殖させました。 構築物 pET28a-lysAB-vT2 および pET28a-lysAB-vT2-fusion を含む組換え大腸菌 BL21 (DE3) を、50 μg/ml のカナマイシンおよび 10 ug/ml を補充した Luria-Bertani (LB) ブロスおよび寒天中で増殖させました。クロラムフェニコールの。 このプロトコールはナレスアン大学施設内バイオセーフティ委員会によって承認され、プロジェクト番号は NUIBC MI 64-08-32 でした。

ｐＥＴ２８ａ内の制限部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに隣接するｖＰｈＴ２のエンドリシン遺伝子（アクセッション番号ＭＮ８６４８６５）を、遺伝子合成システム（遺伝子スクリプト）を使用して生成した。 さらに、C末端に疎水性アミノ酸をコードする遺伝子(FILIVFVLIIAP)を付加することにより、pET28a内にエンドリシン疎水性融合を生成した。 エンドリシン遺伝子 (lysAB-vT2) およびエンドリシン疎水性融合体 (lysAB-vT2-融合) を含む pET28a ベクターを大腸菌 DH5α に形質転換し、プラスミドを精製して大腸菌 BL21 (DE3) pLysS にサブクローニングしました。 制限消化を使用して、クローン化フラグメントの完全性を検証しました。 組換えファージ酵素の過剰発現のために、lysAB-vT2 または lysAB-vT2-融合 (A600-0.5) を含む pET28a を含む大腸菌 BL21 (DE3) pLysS の対数期培養を、IPTG を最終濃度 1 まで添加することによって誘導しました。んん。 37℃で4時間インキュベートした後、細胞をペレット化し、洗浄し、-80℃で凍結しました。 凍結細胞を10 mlの溶解バッファー（145 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 7.4）に再懸濁しました。 サンプルを 3 ～ 4 回凍結融解し、その後 100 μl Triton X-100 (最終濃度 1% v/v) を加え、透明なライセートが観察されるまで氷上で超音波処理しました。 その後、サンプルを 12,000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清（可溶性画分）を回収し、製造業者の指示に従ってＨｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｋｉｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）を使用して組換えタンパク質を精製した。 精製したタンパク質画分をプールし、透析緩衝液に対して一晩透析した。 タンパク質の純度は、12% SDS-PAGE、続いてクーマシー ブリリアント ブルー G-250 で SDS-PAGE ゲルを染色することによってチェックしました。

プレート溶解アッセイは、A. バウマンニ ATCC 19606、A. バウマンニ AB003 (MDRAB)、A. バウマンニ AB329 (XDRAB)、大腸菌 ATCC 25922、緑膿菌 ATCC 27853、肺炎桿菌 ATCC 27736 の細菌細胞を使用して、前述のように 7 実施しました。ブドウ球菌とか細菌を対数増殖期中期まで増殖させ、収集し、１回洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。 次いで、懸濁液をオートクレーブし、遠心分離した。 得られたペレットをＰＢＳ（初期培養体積の２％［体積／体積］）に再懸濁し、基質として使用した。 5μlの精製酵素(4mg/ml)を、基質(5%)を含む寒天プレート(1.5%)上にスポットした。 等量の20μgの卵白リゾチーム(EWL)を対照として使用した。 スポットされたプレートを室温でインキュベートした。 透明ゾーンを観察し、透明ゾーンの直径を測定した。

A. バウマンニ ATCC 19606 および A. バウマンニ臨床分離株に対する lysAB-vT2 または lysAB-vT2 融合体の MIC は、Clinical and Laboratory Standards Institute の標準ブロス微量希釈法に従って決定されました 24。 簡単に説明すると、各酵素の 2 倍連続希釈物を、滅菌 96 ウェル U 底マイクロタイター プレート内のミュラー ヒントン ブロス (MHB) で調製しました。 接種材料は、LBA 上で A. baumannii を培養することによって調製され、37 °C で一晩保存されました。 A. baumannii のコロニーを、濃度計を使用して 0.5 マクファーランドの接種濃度で 0.85% NaCl 溶液に再懸濁し、1 × 105 CFU/ml の濃度を達成しました。 接種材料の最終濃度が 0.5 × 105 CFU/ウェルになるように、各ウェルに 50 μl の細菌溶液を接種しました。 プレートを 37 °C で一晩インキュベートしました。 MICは、目に見える増殖を阻害する酵素の最低濃度として定義されました。

lysAB-vT2 または lysAB-vT2 融合体と 3 つの抗生物質 (イミペネム、コリスチン、ポリミキシン B)、3 つの消毒剤 (第 4 級アンモニウム化合物 (QAC)、クロロキシレノール、次亜塩素酸ナトリウム)、2 つの重金属 (CuCl2、ZnCl2)、およびバクテリオファージとの相互作用vPhT2は、2つの薬剤のMICの0.25倍で増殖阻害アッセイによってスクリーニングされました。 すべての薬剤の試験のための宿主はATCC 19606であった。バクテリオファージの試験にはA. baumannii AB329を使用した。 阻害パーセントは以下の式で計算されました。

チェッカーボードブロス微量希釈法を使用して、lysAB-vT2-融合体と選択された抗生物質との相互作用を決定しました30。 個別にまたは組み合わせて作用する 2 つの薬剤の試験結果を使用して、2 つの薬剤の分数阻害濃度 (FIC) の合計である FIC インデックス (FICI) を次の式で計算しました: FIC インデックス = lysAB-vT2-融合の FIC + FICここで、FIC lysAB-vT2-融合は、組み合わせにおけるlysAB-vT2-融合のMIC/lysAB-vT2-融合単独のMICであり、FIC抗生物質は、組み合わせにおける抗生物質のMIC/抗生物質単独のMICである。

強化された薬剤の FIC 指数は次のように解釈されました。FIC ≤ 0.5、相乗的。 FICI = 0.5 ～ 4、相加的または無関心。 FICI > 4、拮抗性25。

大腸菌 ATCC 25922、緑膿菌 ATCC 27853、肺炎桿菌 ATCC 27736、および薬剤感受性株 (NR)、多剤耐性 A. バウマンニである A. バウマンニのさまざまな株に対する lysAB-vT2 融合体の抗菌活性(MDRAB)、極度薬剤耐性 A. バウマンニ (XDRAB)、カルバペネム耐性 A. バウマンニ (CRAB)、およびコリスチン耐性 A. バウマンニ (COLRAB) を試験しました。 簡単に説明すると、A. baumannii を LB 寒天培地で培養し、37 °C で一晩インキュベートしました。 次に、培養物を LB ブロスで希釈し、細胞懸濁液の濁度を、濃度計で測定して約 1 × 108 CFU/ml に相当する 0.5 マクファーランド標準に調整しました。 調整した細胞懸濁液を２倍強化ミューラーヒルトンブロスで１：１００に希釈し、５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートのＵ底（ヌンク、米国）に接種した。 MIC濃度(2mg/ml)の酵素50μl、またはサブMIC濃度のコリスチン(0.5μg/ml)を含む酵素(10μg/ml)を各ウェルに添加した。 ３７℃で一晩インキュベートした後、５０μｌの０．１％フィルター滅菌ＴＴＣ（Ｈｉ－ｍｅｄｉａ）を添加した。 プレートを室温、暗所で３時間インキュベートした。 OD540 での吸光度は、Synergy 2 マルチモードマイクロプレートリーダー (BioTek Instruments、Winooski、VT、USA) を使用して測定しました。 実験は 3 つのサンプルを使用して 2 回繰り返されました。 すべての A. baumannii に対する阻害率は、前述のように計算されました 7。

さまざまな温度条件下での抗菌活性の安定性を測定するために、2 mg/ml の lysAB-vT2 融合体を 4、20、40、60、および 80 °C でそれぞれ 30 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、細菌阻害アッセイを使用して抗菌活性を測定しました。 熱処理後にタンパク質濃度を測定し、タンパク質の減少率を計算しました。

バイオフィルムアッセイでは、エンドリシンとファージ vPhT2 を 72 時間培養した A. baumannii AB183 バイオフィルム生成株に適用し、72 時間バイオフィルムを除去する精製エンドリシンの能力を最小バイオフィルム根絶濃度アッセイ (MBEC アッセイ) によって評価しました。 バイオフィルムを LB ブロス中で 37 °C で 72 時間増殖させ、さまざまな濃度の精製エンドリシンと、ミューラー ヒントンブロス中の 1 × 108 PFU/ml のファージ vPhT2 に 24 時間曝露しました。 エンドリシン-ファージアジュバントアッセイは、72時間の成熟AB183バイオフィルムをファージおよびエンドリシンで同時かつ連続的に処理することにより実施した。連続処理では、最初にバイオフィルムをファージvPhT2で24時間処理し、その後、lysAB-vT2融合エンドリシンで24時間処理した。 処理後、バイオフィルムを超音波処理して PBS に入れ、超音波処理したバイオフィルムを含む得られた PBS をプレーティングすることによってバイオフィルム内の生存細菌の数を定量し、CFU を決定しました。 細胞毒性アッセイには、ヒト T24 膀胱上皮細胞 (ATCC® HTB-4™) および A. baumannii AB183 を使用し、以前の記載どおりに調製しました (Styles 2020)。 LDH 細胞毒性アッセイは、製造元のプロトコルに従って Invitrogen CyQUANT キットを使用して実施されました。

すべてのテストは独立して 3 回実行され、データは平均 ± 標準偏差として表示されました。 データ分析は、対照とのグループ比較には一元配置分散分析を使用し、ペアごとの比較には対応のない T 検定を使用して実行されました (図 7A)。 p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

この研究のデータセットは補足表に含まれています。

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この研究は、Newton Fund – NRCT Thai Research and Innovation Partnership Fund、British Council Newton Fund Institutional Links Award、SS および APS への申請 ID: 623760210 からの助成金、およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BBSRC) および大学によって支援されました。ワーウィックは、GKD、NB、および APS.UL に対してミッドランド統合バイオサイエンス トレーニング パートナーシップ (MIBTP) [助成金番号 BB/M01116X/1] に資金を提供し、ロイヤル ゴールデン ジュビリー博士号の支援を受けました。 プログラム (PHD/0227/2560)。 GKD と NB は、ミッドランド統合バイオサイエンス トレーニング パートナーシップの資金提供を受けて博士課程の学生制度を開催しています。 PT は、英国とタイの研究およびイノベーション パートナーシップ基金の下で、Institutional Links Grant (623760210) によって資金提供を受けました。

ナレスワン大学医科学部微生物学および寄生虫学部門、ムアン、ピサヌローク、65000、タイ

スティラット シティサック、スパットラ マンルアン、スパパット コンファク、ウドムルク ルントンカム、ラピー トゥンミーパック、アウンチャリー タンウィサイ

ナレスワン大学医科学部、医療バイオテクノロジーセンター、ピサヌローク、65000、タイ

スティラット・シティサク

ウォリック大学生命科学部、コベントリー、CV4 7AL、英国

ネイサン・バートン、ガーニート・K・ダノア、ティモシー・ツァプラス、アントニア・P・サゴナ

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SS および APS: 研究の概念化と監督。 SS、APS、RT、AT: 実験を考案、設計しました。 SS: データの解釈。 SM、SK、UL、NB、GKD、PT: データとバイオインフォマティクス分析を実行しました。 UL、SM、SK、NB、GKD、PT: 実験を実行し、図を準備しました。SS: 原稿の最初の草稿を書きました。 APS: 原稿を編集しました。 SSとAPS：資金調達。 すべての著者は原稿を読んで承認しました。

Sutthirat Sitthisak または Antonia P. Sagona への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Sitthisak、S.、Manrueang、S.、Khongfak、S. 他。 コリスチンと組み合わせたvB_AbaM_PhT2ファージ疎水性アミノ酸融合エンドリシンのアシネトバクター・バウマンニに対する抗菌活性。 Sci Rep 13、7470 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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受領日: 2022 年 8 月 31 日

受理日: 2023 年 4 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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